紫外分光光度法测定鱼肝油中维生素a的含量|上海而立环保科技有限公司-开云体育买球app下载

紫外分光光度法测定鱼肝油中维生素a的含量

一、原理

维生素a的异丙醇溶液在325nm波长处有*大吸收峰，其吸光度与维生素a的含量成正比。

二、试剂

维生素a标准溶液：视黄醇85%（或视黄醇乙酸脂90%）经皂化处理后使用。称取一定量的标准品，用脱醛乙醇溶解使其浓度大约为1mg/ml。临用前需进行标定。取标定后的维生素a标准溶液配制成10 i.u/ml的标准使用液。

标定：取维生素a溶液若干微升，用脱醛乙醇稀释3.00ml，在325nm处测定吸光度，用此吸光度计算出维生素a的浓度。

    c——维生素a的浓度g/ml

    a——维生素a的平均吸光度值

    s——加入的维生素a溶液量µl

    e——1%维生素a的比吸光系数：

无水脱醛乙醇：取2g硝酸银溶入少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入盛有1l乙醇的试剂瓶中，振摇后，暗处放置两天（不时摇动促进反应）。取上层清液蒸馏，弃去初馏液50ml。

酚酞：用95%乙醇配制成1%的溶液。

1:1氢氧化钾；0.5mol/l 氢氧化钾；无水乙醚：不含过氧化物；异丙醇

三、操作步骤

1、样品处理

皂化：称取0.5-5g充分混匀的鱼肝油于三角瓶中，加入10ml1:1氢氧化钾及20-40ml乙醇，在电热板上回流30分钟。加入10ml水，稍稍振摇，若有混浊现象，表示皂化完全。

提取：将皂化液移入分液漏斗，先用30ml水分两次洗涤皂化瓶（若有渣，可用经过脱脂棉过滤），再用50ml乙醚分两次洗涤皂化瓶，所有洗液并入分液漏斗中，振摇两分钟（注意放气），静止分层后，水层放入第二分液漏斗。皂化瓶再用30ml乙醚分两次洗涤，洗液倒入第二分液漏斗，振摇后静止分层，将水层放入第三分液漏斗，醚层并入**分液漏斗。重复操作3次。

洗涤：向**分液漏斗的醚液中加入30ml水，轻轻振摇，静止分层后放出水层。再加15-20ml0.5mol/l的氢氧化钾溶液，轻轻振摇，静止分层后放出碱液。再用水同样操作至洗液不使酚酞变红为止。醚液静止10-20分钟后，小心放掉析出的水。

浓缩：将醚液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25ml乙醚洗涤分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶中。用水浴蒸馏回收乙醚，待瓶中剩余约5ml乙醚时取下减压抽干，立即用异丙醇溶解并移入50ml容量瓶中用异丙醇定容。

2、绘制标准曲线

分别取维生素a标准使用液0.00,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00ml于10ml容量瓶中用异丙醇定容。以零管调零，于紫外分光光度计上在325nm处分别测定吸光度，绘制标准曲线。

3、样品测定

取浓缩后的定容液于紫外分光光度计上在325nm处测定吸光度，通过此吸光度从标准曲线上查出维生素a的含量。

四、计算                   

维生素a（i.u/100g）=                         

c——测出的样品浓缩后的定容液的维生素a的含量i.u/ml

v——浓缩后的定容液的体积ml

m——样品的质量g